百家之才   行业之杆
PCR技术的原理与方法(一)
浏览数:4

PCR定义

PCRPolymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。

PCR技术的基本原理

.PCR反应成分:

1.模板DNA2.引物;3.四种脱氧核糖核苷酸;

4.DNA聚合酶;5.反应缓冲液、Mg2+等。

.PCR反应基本步骤:

1.变性:高温使双链DNA解离形成单链(94℃,30s)。

2.退火:低温下,引物与模板DNA互补区结合(55℃,30s)。

3.延伸:中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(7072℃,3060s

1.变性(denaturation):通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂,双链分开而成单链的过程。

2.退火(annealling):当温度降低时,引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。

3.延伸(extension):在DNA聚合酶、dNTPs Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

以上述三个步骤为一个循环,每一循环的产物均可作为下一个循环的模板,经过n次循环后,目的DNA2n的形式增加。

PCR反应的成分和作用

总体积:一般为25μl100 μl

(一)无Mg2+buffer:由纯水、kclTris组成。Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度,但不能超过50 mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。

(二)Mg2+:终浓度为1.52.0mmol/L,其对应dNTP200 μmol/L,注意Mg2+dNTPs之间的浓度关系,由于dNTPTaq酶竟争Mg2+,当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。

(三)BSA:一般用乙酰化的BSA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用,对Taq酶有保护作用。

(四)底物(dNTPs):dNTPs具有较强酸性,其储存液用NaOHpH值至7.07.5,一般存储浓度为10 mmol/L,各成份以等当量配制,反应终浓度为20200μmol/L。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高精确性,而反应速度会降低。

(五)Taq酶:能耐95℃高温而不失活,其最适pH值为8.38.5,最适温度为7580℃,一般用72℃。能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性,没有校正功能。某种dNTPMg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.55个单位/100μl

(六)模板:PCR对模板DNA的纯度不要求很高,但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。

(七)引物:引物浓度一般为0.10.5μmol/L,浓度过高会引起错配和非特异扩增,浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基,引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对,末位碱基最好选用ACG(因T错配也能引发链的延伸)。

引物G+C约占4555%,碱基应尽量随机分布,避免嘧啶或嘌呤堆积,两引物之间不应有互补链存在,不能与非目的扩增区有同源性。


在线客服
 
 
 联系方式
销售部热线:020-3430 0229
技术部热线:020-3430 1321-602
人事部热线:020-3430 1321-201
简历投递:bingbingbai@gzsttc.com